取2-3年生白芷植株的幼葉為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基,附加水解酪蛋白0.5-1毫克/升,按需要加入2,4-D和BA。幼葉經0.1%升汞液表面滅菌、無菌水浸洗后分別將葉片與葉柄切塊接種于含有不同濃度組合的2,4-D與BA的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25℃-28℃,光照用30W熒光燈,培養(yǎng)材料距燈管20-40厘米,每天照光10-12小時。
實驗結果表明:白芷的葉柄為松軟的海綿狀組織,其外植體在含有不同激素的MS培養(yǎng)基上長期培養(yǎng),未見啟動;幼葉葉片切塊在MS附加2,4-D 0.5-2 BA0.2毫克/升培養(yǎng)基上暗處培養(yǎng)70多天,獲得可轉接的愈傷組織,將其轉接到MS附加2,4-D0.01-0.1毫克/升 BA0.01-0.1毫克/升培養(yǎng)基上后,在光照條件下分化出珠狀結構的芽,其大小如豌豆,形似荸薺。進而幼葉2-3片破鞘狀體而出,基部長出粗狀的根,形成了完整的小植物;若轉接到低濃度的2,4-D與BA的MS培養(yǎng)基上,仍在暗處培養(yǎng),則形成大量團狀愈傷組織,并從其局部分化出胚狀體,在光照條件下,胚狀體經不同發(fā)育時期形成再生植株。再生植株的移栽成活率可達100%,植株生長良好,能正常開花結實。對川白芷[A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan]進行了再生植株的研究。經多組實驗研究,最終選擇了葉軸為最佳外植體:取2年生川白芷生長健壯的植株,割取其葉軸部分,清水洗凈,用0.1%的升汞液表面消毒12分鐘,無菌水漂洗5次,在無菌條件下切割接種在MS附加BA1、NAA0.5的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為25±2℃,光照每天8小時,光照強度1500LX。培養(yǎng)25天后,出愈率達到100%,且愈傷組織質地較致密,生長速度適中。繼續(xù)培養(yǎng)至60天后,芽分化率達98%,且綠色叢生芽量多,表現(xiàn)出生機旺盛。當試管苗長至約2.5-3厘米左右高時,從基部切下,接種在1/2MS NAA1、蔗糖減至1.5%的生根培養(yǎng)基上,約10天以后,從切口處開始產生白色突起,20天后多數(shù)刷把狀粗狀的根產生了,平均每株產根10-15條,生根率達95%以上;待根長至1.5-2厘米左右時,直接移出瓶外,洗凈其上的培養(yǎng)基,移入小缽中,先期罩一薄膜袋保濕,約一周后拿掉薄膜袋,每天澆一次水,二周后,移入田間,使其在自然條件下生長,移栽成活率100%。
白芷組培技術再生植株的研究,在本實驗研究過程,中還發(fā)現(xiàn),川白芷組織培養(yǎng)中,加入2,4-D的效果不如NAA與BA結合使用的效果好;葉軸、葉柄為愈傷化明顯的外植體,而葉片與子葉啟動無效;光照下培養(yǎng)25天,愈傷化明顯,50天后便可獲得可轉接的愈傷組織。而在白芷經胚狀體途徑再生植株的實驗中,愈傷組織的生長有賴于2.4-D的加入,且認為葉片為理想的外植體,而葉柄則長期未見啟動;要獲得可轉接的愈傷組織需暗培養(yǎng)70多天。由此可見,不同種類的白芷在選擇外植體和形成愈傷組織的培養(yǎng)條件上是不相同的。 白芷組培技術再生植株的研究